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MARQUEURS MOLECULAIRES BASES SUR LA PCR (RAPD, SSR, AFLP). LIRE L'ADN A TRAVERS SON AMPLIFICATION
المؤشرات الجزيئية المرتكزة على البلمرة المتسلسلة ل دنا. قرائة دنا من خلال تكثيفه
PCR-BASED MOLECULAR MARKERS (RAPD, SSR, AFLP). READ DNA THROUGH ITS AMPLIFICATION


marqueurs moléculaires basés sur PCR: RAPD, SSR, AFLP


MARQUEURS MOLECULAIRES BASES SUR LA PCR (RAPD, SSR, AFLP). LIRE L'ADN A TRAVERS SON AMPLIFICATION
المؤشرات الجزيئية المرتكزة على البلمرة المتسلسلة ل دنا. قرائة دنا من خلال تكثيفه
PCR-BASED MOLECULAR MARKERS (RAPD, SSR, AFLP). READ DNA THROUGH ITS AMPLIFICATION


Le développement de la technique PCR (Polymerase Chain Reaction) offre l'avantage d'analyser les marqueurs moléculaires en un temps court tout en utilisant des concentrations faibles d'ADN. Les marqueurs moléculaires basés sur la technique PCR (RAPD, SSR, AFLP, ..) tendent à remplacer les systèmes classiques (les marqueurs morphologiques, isoenzymatiques et RFLP) et deviennent très nombreux et diversifiés.


Contrairement aux marqueurs moléculaires de type 'RFLP' résultant de la restriction de l'ADN, les marqueurs moléculaires basés sur la PCR concernent les sites de fixation d'amorces ADN. La technique PCR consiste à dénaturer l'ADN qui devient sous forme monocaténaire, lui fixer des amorces et le polymériser avec la Taq DNA polymérase. Les trois températures et leurs temps d'application sont gérées par un thermocycleur.

Thermocycleur PCR

Polymérisation en chaîne de l'ADN


1. Polymorphisme d'amplification aléatoire de l'ADN. Technique RAPD.

La technique RAPD est basée sur la méthode PCR. L'amplification du DNA génomique est, cette fois ci, réalisée à partir d'amorces de séquences aléatoires (10 bases, environ), utilisées seules ou par couples. Lorsqu'une seule amorce aléatoire est utilisée, l'amplification a lieu une fois celle ci se fixe sur 2 sites complémentaires peu distants (maximum théorique de la PCR : 3000 pb).


Random Amplified DNA

Origines du polymorphisme de type 'RAPD'
Les causes du polymorphisme de type RAPD sont:
- Disparition par mutation (mutation ponctuelle, crossing-over, insertion, délétion, ...) d'un ou plusieurs sites de fixation de l'amorce.
- Eloignement, par insertion, des sites de fixation de l'amorce à une distance supérieure à 3000 pb. Il en résulte la disparition de fragments de DNA.
- Rapprochement, par délétion, des sites de fixation de l'amorce à une distance inférieure ou égale à 3000 pb. Il en résulte l'apparition de fragments surnuméraires.
- Rapprochement très accusé des sites de fixation de l'amorce ne donnant lieu qu'à de petits fragments de DNA n'apparaissant pas sur le gel après électrophorèse.
Il apparaît donc que les marqueurs RAPD sont en général dominants, contrairement aux marqueurs RFLP. Ainsi, tous les individus d'une génération F1, résultant d'un croisement de 2 lignées dont l'une possède un marqueur RAPD caractéristique, présentent le même marqueur (la présence d'un marqueur l'emporte sur son absence).


2. Marqueurs de type 'microsatellites' (SSR)

Les microsatellites ou SSR (Morgante, Olivieri, 1993). Ils sont constitués de séquences de di-, tri- ou tétra-nucléotides répétés en tandem (toujours dans le même sens , par opposition à répétitions inversées répétées). Ces éléments sont uniformément répartis en plusieurs exemplaires sur l'ensemble du génome d'une espèce et présentent un taux de polymorphisme élevé. Ce polymorphisme repose sur la variation du nombre d'unités de répétition constituant le microsatellite. Les clones d'ADN qui s'hybrident facilement contiennent des séquences répétés. Pour que ce DNA marqueur puisse être un repère non ambigu, il doit être entouré à droite et à gauche de séquences uniques. Ces deux séquences flanquant les éléments répétés permettent de définir une paire d'amorces qui sera utilisée pour l'amplification PCR. L'analyse des produits amplifiés s'effectue sur gel de polyacrylamide haute résolution (susceptible de séparer des fragments d'ADN de taille faible). Un microsatellite (SSR) est donc défini par:
1/ le motif répété qui le compose et
2/ la paire d'amorces uniques qui l'encadrent et servent à l'identifier et à l'amplifier.
Si les SSR constituent de bons marqueurs moléculaires (reproductibles, codominants et aisés d'utilisation), leur caractérisation initiale est toutefois assez lourde. En effet, leur production doit passer d'abord par le clonage et le séquençage de ces éléments répétés.


Microsatellites

Microsatellites multialléliques

Microsatellites. Allèles

Etant donné qu'il n'existe que de faibles différences de tailles sur les microsatellites, ces marqueurs sont souvent séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (au lieu de l'agarose). Exemples d'électrophorégramme:


Microsatellites: genotypes

Examens: SSR (microsatellites) et détection d'hbrides somatiques Mandarinier x Citrange
- SSR et détection d'hbrides chez le cototon

3. Marqueurs moléculaires basés sur la restriction de l'ADN et l'amplification par PCR

La technique AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism, Vos et al., 1995) est fondée sur la mise en évidence conjointe de polymorphisme de sites de restriction et d'hybridation d'amorces arbitraires. Cette technique utilise à la fois les enzymes de restriction et l'amplification PCR. On distingue les étapes suivantes :
- L'ADN génomique est coupé par deux enzymes de restriction.
- Des adaptateurs de séquences connues et spécifiques des enzymes de restriction utilisées, sont ajoutés aux extrémités des fragments de restriction générant ainsi une matrice pour l'amplification.
- Une première amplification (pré-amplification) est réalisée à l'aide d'amorces de séquences complémentaires à la séquence des adaptateurs et des sites de restriction.
- La deuxième amplification (amplification sélective) utilise des amorces identiques aux premières mais prolongées à l'extrémité 3' de quelques nucléotides arbitraires (de 1 à 3 nucléotides). Ainsi, seuls sont amplifiés les fragments possédant les bases complémentaires de ces bases arbitraires. Ces amorces sélectives permettent de réduire le nombre de fragments amplifiés à une centaine.
- Ces fragments sont séparés par électrophorèse sur gel d'acrylamide dénaturant puis visualisés par coloration au nitrate d'argent ou révélés grâce à un marquage radioactif ou fluorescent réalisé lors de l'amplification sélective.
C'est la combinaison enzyme de restriction/amorce qui permet de révéler le polymorphisme entre les individus. Elle constitue donc le marquage de type AFLP (--> voir figure AFLP ).



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Video 'genetic diversity through molecular markers' (master level, Cadi Ayyad University, 2019:



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- https://www.takween.com/techniques/microsatellites-SSR-marqueurs.pdf

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