Le développement de la technique PCR (Polymerase Chain Reaction) offre l'avantage d'analyser les marqueurs moléculaires en un temps court tout en utilisant des concentrations faibles d'ADN. Les marqueurs moléculaires basés sur la technique PCR (RAPD, SSR, AFLP, ..) tendent à remplacer les systèmes classiques (les marqueurs morphologiques, isoenzymatiques et RFLP) et deviennent très nombreux et diversifiés.
Contrairement aux marqueurs moléculaires de type 'RFLP' résultant de la restriction de l'ADN, les marqueurs moléculaires basés sur la PCR concernent les sites de fixation d'amorces ADN. La technique PCR consiste à dénaturer l'ADN qui devient sous forme monocaténaire, lui fixer des amorces et le polymériser avec la Taq DNA polymérase. Les trois températures et leurs temps d'application sont gérées par un thermocycleur.
La technique RAPD est basée sur la méthode PCR. L'amplification du DNA génomique est, cette fois ci, réalisée à partir d'amorces de séquences aléatoires (10 bases, environ), utilisées seules ou par couples. Lorsqu'une seule amorce aléatoire est utilisée, l'amplification a lieu une fois celle ci se fixe sur 2 sites complémentaires peu distants (maximum théorique de la PCR : 3000 pb).
Origines du polymorphisme de type 'RAPD'
Les causes du polymorphisme de type RAPD sont:
- Disparition par mutation (mutation ponctuelle, crossing-over, insertion, délétion, ...) d'un ou plusieurs sites de fixation de l'amorce.
- Eloignement, par insertion, des sites de fixation de l'amorce à une distance supérieure à 3000 pb. Il en résulte
la disparition de fragments de DNA.
- Rapprochement, par délétion, des sites de fixation de l'amorce à une distance inférieure ou égale à 3000 pb. Il en résulte l'apparition de fragments surnuméraires.
- Rapprochement très accusé des sites de fixation de l'amorce ne donnant lieu qu'à de petits fragments de DNA n'apparaissant pas sur le gel après électrophorèse.
Il apparaît donc que les marqueurs RAPD sont en général dominants, contrairement aux marqueurs RFLP. Ainsi, tous les individus d'une génération F1, résultant d'un croisement de 2 lignées dont l'une possède un marqueur RAPD caractéristique, présentent le même marqueur (la présence d'un marqueur l'emporte sur son absence).
Les microsatellites ou SSR (Morgante, Olivieri, 1993). Ils sont constitués
de séquences de di-, tri- ou tétra-nucléotides répétés en tandem (toujours dans le même
sens , par opposition à répétitions inversées répétées). Ces éléments sont uniformément répartis en plusieurs exemplaires sur l'ensemble du génome
d'une espèce et présentent un taux de polymorphisme élevé. Ce polymorphisme repose sur la variation du nombre d'unités de répétition constituant le microsatellite. Les clones d'ADN
qui s'hybrident facilement contiennent des séquences répétés. Pour que ce DNA marqueur puisse être un repère non ambigu,
il doit être entouré à droite et à gauche de séquences uniques. Ces deux séquences flanquant les éléments répétés permettent de
définir une paire d'amorces qui sera utilisée pour l'amplification PCR. L'analyse des produits amplifiés s'effectue sur gel de
polyacrylamide haute résolution (susceptible de séparer des fragments d'ADN de taille faible). Un microsatellite (SSR) est donc
défini par:
1/ le motif répété qui le compose et
2/ la paire d'amorces uniques qui l'encadrent et servent à l'identifier et à l'amplifier.
Si les SSR constituent de bons marqueurs moléculaires (reproductibles, codominants et aisés d'utilisation), leur caractérisation
initiale est toutefois assez lourde. En effet, leur production doit passer d'abord par le clonage et le séquençage de ces éléments répétés.
Etant donné qu'il n'existe que de faibles différences de tailles sur les microsatellites, ces marqueurs sont souvent séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (au lieu de l'agarose). Exemples d'électrophorégramme:
La technique AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism, Vos et al.,
1995) est fondée sur la mise en évidence conjointe de polymorphisme de sites de restriction et d'hybridation d'amorces arbitraires.
Cette technique utilise à la fois les enzymes de restriction et l'amplification PCR. On distingue les étapes suivantes :
- L'ADN génomique est coupé par deux enzymes de restriction.
- Des adaptateurs de séquences connues et spécifiques des enzymes de restriction utilisées, sont ajoutés aux extrémités des fragments de restriction générant ainsi une matrice pour l'amplification.
- Une première amplification (pré-amplification) est réalisée à l'aide d'amorces de séquences complémentaires à la séquence des adaptateurs et des sites de restriction.
- La deuxième amplification (amplification sélective) utilise des amorces identiques aux premières mais prolongées
à l'extrémité 3' de quelques nucléotides arbitraires (de 1 à 3 nucléotides). Ainsi, seuls sont
amplifiés les fragments possédant les bases complémentaires de ces bases arbitraires. Ces amorces sélectives permettent de
réduire le nombre de fragments amplifiés à une centaine.
- Ces fragments sont séparés par électrophorèse sur gel d'acrylamide dénaturant puis visualisés par coloration
au nitrate d'argent ou révélés grâce à un marquage radioactif ou fluorescent réalisé lors de
l'amplification sélective.
C'est la combinaison enzyme de restriction/amorce qui permet de révéler
le polymorphisme entre les individus. Elle constitue donc le marquage
de type AFLP (--> voir figure AFLP ).
Video 'genetic diversity through molecular markers' (master level, Cadi Ayyad University, 2019:
- Sélection Assistée par Marqueurs (MAS)
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- Sélection des plantes allogames. Exercice
- RFLP et sélection des protoplastes chez l'oranger. Examen S5_2012
- RAPD et amélioration
de la tomate pour la résistance à la verticilliose, RFLP. Examen S5_2012
- RFLP, RAPD et sélection chez le Cyprès du Japon (examen 2013)
- SSR (microsatellites) et mildiou de la tomate (Examen S5, 2013)
- Marqueurs PCR de type RAPD et microsatellites chez coton (Contrôle S5, 2014)
- Isoenzymes et détection d'hbrides interspécifique chez Cuphea
- Transformation
génétique du bouleau, test Southern blotting (Contrôle S6)
- Marqueurs RAPD et SSR et test de la pureté des semences chez la tomate (examen 1, 2019
- isoenzymes-mutations (pdf)
- isoenzymes-detection (pdf)
- isoenzymes-loci-alleles(pdf)
- RFLP (pdf)
- RAPD (pdf)
- AFLP (pdf)
- https://www.takween.com/techniques/microsatellites-SSR-marqueurs.pdf
SIMULATIONS (VIRTUAL LABORATORY):
- DNA electrophoresis on agarose gel step by step
- DNA electrophoresis. Simulation (virtual laboratory)
- The virtual Bacterial ID Laboratory and PCR Simulation (virtual laboratory)
- Faire un Quiz formatif (Contrôle noté) sur les Biotechnologies des Plantes et Marqueurs moléculaires
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