Etant
de caractère codominant, les marqueurs RFLP peuvent être utilisé dans la sélection d'hybrides somatiques provenant de la fusion des protoplastes. Ici, le cas de l'oranger (Citrus sinensis) traité dans le cadre d'un examen de rattrapage S5 (Module 'Génétique et amélioration des Plantes'..
Examen de l'élément de module 'Génétique et Amélioration des plantes'' (partie 'marquage moléculaire
et amélioration des plantes'), module 'Biochimie, Génétique et Amélioration des Plantes' du Parcours S5 : 'Biologie Appliquée aux Productions Végétales', Janvier 2012, durée : 45 minutes ......
Corrections brèves à la fin de l'épreuve
L'oranger (Citrus sinensis L.) est un arbre fruitier de la famille des Rutacées, plantes qui produisent les agrumes. L'oranger est un hybride ancien résultant probablement d'un croisement entre le pamplemousse (Citrus maxima) et la mandarine (Citrus reticulata). Décidant d'améliorer génétiquement cette espèce (appelée 'Trovita orange', Shinozaki et al. (1992, Japan J. Breed. 42, 227-95) ont réalisé la fusion des protoplastes de cet oranger avec ceux de l'espèce Murraya paniculata (orange sauvage ou 'oranger jasmin') qui s'adpte bien aux sols alcalins, en plus d'être résistante aux nématodes (voir figure ci-dessous). Les plantes régénérées à partir des protoplastes fusionnés ont été analysées pour le polymorphisme de restriction de leurs ADN par la technique 'RFLP'.
L'ADN a été hydrolysé séparément par deux enzymes de restriction (Afa1 et Xho1). L'hybridation a été réalisée par une sonde hétérologue (ADN de riz) marquée à la peroxydase. Les résultats obtenus sont résumés dans la figure ci-dessous.
Questions
1) Quelles peuvent être les raisons possibles de recours à d'autres espèces de rutacées (comme Murraya paniculata) pour l'amélioration génétique de l'oranger (Citrus sinensis) ?
2) Rappeler brièvement la technique de fusion des protoplastes dans la création variétale.
3) Quel(s) critère(s) moléculaire(s) exploite la technique
d'électrophorèse de l'ADN. S'il s'agit de plusieurs critères, en préciser le principal. Justifier votre
réponse
4)
Rappeler les étapes principales de la technique 'RFLP'.
5)
Interpréter les électrophorégrammes correspondant à la digestion par les enzymes de restriction Afa1 et Xho1 des ADN provenant de 'orange jessamine' (Murraya paniculata, O), 'orange Trotiva' (Citrus sinensis, T) et de l'hybride résultant
de la fusion des protoplastes (TO). Quelles sont les conclusions à tirer quant à l'efficacité d'utilisation du marquage de type 'RFLP' dans ce genre d'étude?. Justifier votre réponse.
Corrections brèves
Réponse
à la Question 1: Les raisons possibles à l'origine du recours à d'autres espèces de rutacées (comme Murraya paniculata, oranger sauvage) pour l'amélioration
génétique de l'oranger (Citrus sinensis) résident essentiellement dans le rétrécissement de la diversité génétique de l'oranger (Citrus sinensis). Le recours à d'autres espèces proches devient nécessaire. Il n'est pas exclu que les auteurs projettent l'introduction dans l'oranger des traits agronomiques de l'adaptation au sols alcalins et la résistance aux nématodes.
Lien utile : Amélioration
génétique des plantes
Réponse à la Question 2: La préparation des protoplastes dans le but de réaliser leur fusion, consiste à détruire la paroi cellulaire par
digestion enzymatique, grâce à des enzymes telles que la pectinase, la cellulase ou le lysozyme. On obtient ainsi des cellules
sphériques. Ensuite, les cellules sont fusionnées par PEG ou par application d'un courant électrique dans le but d'obtenir des hybrides somatiques.
Réponse à la Question 3: L'éléctrophorèse de l'ADN exploite les critères
de la taille et de l'ionicité (charge électrique). Cependant, la même charge (-) des fragments de l'ADN (dues au phosphore)
entraîne une séparation sur le critère de la taille, uniquement. La forme des fragments d'ADN résultant de la digestion
de l'ADN n'intervient pas dans la séparation.
Lien utile : Techniques
biochimie
Réponse à la Question 4:
Les étapes principales de la technique RFLP sont :
- Purification suffisante de l'ADN
- Digestion de l'ADN par une enzyme de restriction
- Electrophorèse des fragments d'ADN sur gel
- Transfert des fragments d'ADN séparés sur membrane de
nitrocellulose
- Hybridation des fragments par une sonde (homologue ou hétérologue)
marquée par une enzyme (comme la peroxydase) ou par radioactivité
Lien utile : RFLP
Réponse à la Question 5: Interprétation des électrophorégrammes obtenus avec les deux enzymes de restriction :
- Enzyme de restriction Afa1 :
On constate que l'hybride somatique hérite de l'oranger sauvage
(Murraya paniculata) et de l'ornager cultivé plusieur
séquences nucléotidiques (représentées par
des bandes), dont :
- Bande de Rf d'environ 0.25 qui provient de Murraya paniculata,
mais n'existant pas chez l'oranger cultivé (Citrus sinensis)
- Bande de Rf égal à 0,35, environ existant uniquement
chez l'oranger cultivé
- Enzyme de restriction Xho1 :
Avec l'enzyme de restriction Xho1, on découvre que l'ADN de l'hybride somatique contient des séquences nucléotidiques provenant des deux espèces d'oranger. On peut en citer le fragment
d'ADN correspondant à la bande de approximatif 0,60 (taille proche de 4,4 kbp) hérité de l'oranger sauvage, mais n'existant pas chez l'oranger cultivé.
Les fragments d'ADN caractéristiques des deux espèces d'oranger sont apparents chez l'hybride somatique. Ceci témoigne
de la codominance du marquage de type RFLP. Le caractère
codominant des marqueurs RFLP fait d'eux des outils moléculaires
puissants dans l'identification des hybrides.
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