biotechnologies

TRANSGENESE, GENIE GENETIQUE


SOMMAIRE

- Définition de la transgénèse
- Structure d'un gène chez les eucaryotes
- Agrobacterium tumefaciens comme exemple de vecteur de transgènes
- Procédés de transfert des gènes chez les plantes
- Devenir du transgène. Dépendance du type de vecteur
- Visualisation de l'expression des transgènes à l'aide des gènes rapporteurs dans la transgénèse des plantes. Exemples de gènes rapporteurs dans la transgénèse des plantes
---> Gène LacZ codant pour la béta-galactosidase de la bactérie E coli.
---> Gène codant pour la GFP (green fluorescent protein)
---> Gène gus (béta-glucuronidase)
- Régulation de l'expression des gènes
- Fusion transcriptionnelle et fusion traductionnelle
- Gènes rapporteurs. Fusion transcriptionnelle et fusion traductionnelle
- Etapes de la transgénèse chez les plantes
---> Etape 1 : Identification, isolement, intégration et multiplication d'un gène d'intérêt
---> Etape 2 : Transfert du gène d'intérêt et sélection de cellules et tissus transformés
---> Etape 3 : Régénération et évaluation des plantes transformées.
---> Etape 4 : Incorporation du transgène dans une variété commerciale et obtention d'une 'variété OGM'
---> Obtention d'une variété OGM
- Tests de caractérisation moléculaire et biochimique des transformants
---> Caractérisation moléculaire des transformants et vérification de l'intégration du transgène.
---> Caractérisation biochimique des transformants et test de l'expression du transgène.
- Evaluation de la valeur agronomique de la plante
- Différents types de modulation de l'expression des transgènes. Exemples
---> Transformation sens. Exemple de la chitinase
---> Modulation par les facteurs cis-régulateurs et les facteurs trans-régulateurs
---> Transformation antisens. Exemple de la plygalacturonase chez la tomate flavr-savr
---> Transformation par ARN d'interférence (RNAi). Exemple de l'enzyme débranchante de l'amidon
---> Production d'une nouvelle molécule. Exemple des enzymes de biosynthèse de la vitamine A chez le riz doré
- TD N°1: Analyse d'articles sur la transgénèse. Cas de la pomme de terre transformée pour la résistance au doryphore (coléoptère)


DEFINITIONS

transgénèse (transgenesis, تحوير المورث) ou modifications génétique résulte du génie génétique (genetic engineering, هندسة وراثية). Agrobacterium tumefaciens est un exemple de vecteur de transgènes à travers son plasmide Ti.
La transgenèse consiste en une introduction d'un gène étranger provenant d'une espèce donneuse dans le matériel génétique d'une autre espèce (espèce receveuse). Il s'agit d'une addition d'un gène ou d'un remplacement d'un gène (chez animaux).
- L'organisme obtenu est un organisme transgénique.
- Le gène transféré est appelé transgène ou encore gène d'intérêt.


ORGANISMES GENETIQUEMENT MODIFIES (OGM)
L'organisme transgénique est appelé 'Organisme génétiquement modifié (OGM). Le nombre des OGMs dans le monde est en augmentation. Cliquer sur ce lien pour voir l'image complète de la culture des OGMs au Monde
OGM (GMO). Evolution.

STRUCTURE D'UN GENE CHEZ LES EUCARYOTES
Gène (gene). Organisation

Plus de détail sur la structure d'un gène. Une fois introduit dans le génome de l'espèce receveuse et s'il arrive à s'exprimer, le transgène entraîne la production d'une nouvelle protéine par l'organisme transgénique. Ainsi, l'espèce receveuse acquiert un nouveau caractère.

transgénèse
Agrobacterium tumefaciens COMME EXEMPLE DE VECTEUR

Comment est réalisé le transfert du transgène? Prenons le cas d'un transfert naturel conduit par une 'bactérie intelligente'. Cas d'Agrobacterium tumefaciens et transfert naturel des gènes. Cette agrobactérie ne fait qu'injecter un seul brin de l'ADN de son plasmide, attend dehors, fait travailler la plante pour elle et récupère tranquilement sa nourriture !!.
Agrobacterium tumefeciens

Agrobacterium tumefaciens

La bactérie Agrobacterium tumefaciens est un pathogène plasmide circulaire de 200 Kb (plasmide Ti pour Tumor inducing)). Il induit des tumeurs en agissant sur les hormones.
Le développement in vitro de plants issus de la culture in vitro dépend essentiellement des taux d'auxines et de cytokinines.Micropropagation d'espèces végétales (cours). Cette bactérie a la faculté exceptionnelle de transférer une partie de son ADN (ADN-T) dans le génome de la plante réceptrice (dicotylédone), qui développe alors une gale à l'endroit de la blessure ayant permis la pénétration de l'ADN-T. Le fragment d'ADN T est entouré par deux régions, les frontières droite (FD) et gauche (FG) constituées de répétitions imparfaites d'un motif de 25 bp. Ces deux frontières sont indispensables pour l'initiation et la terminaison de l'expression des gènes de l'ADN T (ONC et OPS). Plus de détail (Fr, Ar) sur le transfert de l'ADN T d'Agrobacterium tumefaciens dans la plante, كيف يحدث هذا؟.
D'où l'idée d'utilisation d'Agrobacterium tumefaciens comme vecteur des transgènes. Nénmoins, il faut remédier à 2 contraintes principales:
Contrainte 1. Pour éviter le développement de la gale par la plante transformée (qui entraînerait sa mort), on utilise un plasmide Ti désarmé est amputé de l’ADN-T, y compris les gènes oncogènes et les séquences bordures. Il comporte un gène de résistance à un antibiotique qui permet de sélectionner ce plasmide 'désarmé' là ou il se trouve. Aussi on peut y mettre à la la place un gène d'intérêt (GI) avec un gène marqueur (gène de sélection, GS). Il est toutefois nécessaire, pour la réalisation du transfert de gènes, de garder intactes les deux bordures gauche et droite de l'ADN-T, ainsi que les fonctions de virulence.
ADN T et transgène

Les gènes vir sont activés par trois types de signaux chimiques que la plante relâche en cas de blessure. Ils sont 1/ composés phénoliques dérivés du syringol (acétosyringone). 2/ monosaccharides tels que glucose et acide glucuronique et 3/ pH acide. Comment un gène se réveille-t-il? Promoteur inductif?, Promoteur constitutif?
Contrainte 2. Le plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens étant de grand taille (environ 200 Kb, difficile à manipuler in vitro) et ne possède pas de site unique de clonage. Il est donc nécessaire de cloner le gène d'intérêt dans un petit plasmide d'environ 10 Kb (de E. Coli, par exemple) qui présente une zone d'homologie avec Ti et qui va porter l'ADN-T recombiné (construction génétique) + bordures gauche et droite de l'ADN-T.
Agrobacterium Ti plasmid cannot be used as gene cloning vector because of: 1/ Large size of Ti plasmide (difficult to handle), 2/ Presence of oncogenes (tumor causing genes --> cytokinin and auxin) and 3/ Lack of unique restriction sites and marker sites within T-DNA. So, there are two genetically engineered Ti plasmid based vectors: cointegrate vectors and binary vectors.

QCM 1. Génie génétique (souvenir du bac!, Ar, Fr)
QCM 2. connaissances de base Biotechnologies




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    Transgénèse, génie génétique