transgénèse. Marqueurs de sélection, Gènes rapporteurs (LacZ, GUS, GFP)

TRANSGENESE CHEZ LES PLANTES. GENES DE SELECTION (nptII), GENES RAPPORTEURS (LacZ, gus, GFP)

Gènes de séléction des cellules et tissus transformés

Etant donné que le taux de transformation génétique des plantes est généralement très faible, des marqueurs de sélection sont utilisés pour assurer la survie des cellules transformées sur un milieu sélectif et inhiber la régénération de cellules non transformées. Une plante transformée avec un gène permettant de métaboliser un composé précis confère une résistance, ou une capacité à utiliser ce composé. Cependant, certaines plantes non transformées mais présentant une résistance intrinsèque, peuvent résister à la sélection en supportant la dose de l'agent de sélection appliquée (antibiotique, herbicides, ..). Dans ce cas, on parle d'échappement. Le gène de sélection peut conférer une résistance par plusieurs mécanismes dont 1/ coder pour une protéine qui permet de détoxiquer l'agent de sélection, 2/ coder pour une protéine mutée, insensible à l'agent de sélection et 3/ surexprimer un gène, qui permet d'accroître la résistance à l'agent de sélection.

Selectable Markers. Examples:
- nptII, hpt genes (for resistance to the aminoglycoside antibiotics, kanamycin and hygromycin)

Le gène nptII code pour une aminoglycoside 3'-phosphotransferase (NPTII) qui inactive par phosphorylation une série d'antibiotiques de type aminoglycosides comme la kanamycine et la néomycine, ..
- bar gene (for resistance to herbicide phosphinothricin)
- DHFR gene (for resistance to methotrexate)
- ESPS gene (for resistance to Round-up herbicide)

Selectable markers are different from screenable markers (reporter genes)! (gènes rapporteurs)

Depuis quelques années, il y'a eu développement de l'utilisation de la sélection positive qui permet de sélectionner les plantes transformées sans tuer celles qui ne le sont pas. Ainsi, l'insertion d'un gène dans les cellules leur permet d'avoir un avantage métabolique en les poussant à produire une substance essentielle à leur croissance absente dans le milieu de culture. Comme exemple de sélection positive, on peut citer l'utilisation des gènes codant pour des enzymes permettant la conversion d'un sucre non-métabolisable (mannose, xylose) en une source carbonée utilisable.

GENES RAPPORTEURS

Visualisation de l'expression des transgènes chez les plantes régénérées à l'aide des gènes rapporteurs dans la transgénèse des plantes
Comme pour le gène de sélection (gènes marqueurs), le choix du gène rapporteur doit se faire en fonction de la nature du matériel végétal. En effet, certaines plantes ont des activités endogènes qui sont capables de masquer l'expression d'un gène rapporteur.
Après transformation et régénération d'une plante, on peut distinguer 3 cas, dont 1/ La plante régénérée n'est pas transformée, mais naturellement résistante à l'agent de sélection, 2/ L'ADN-T peut avoir été transféré partiellement. Le gène de résistance à l'antibiotique est présent, mais pas le gène rapporteur (ou en partie) et 3/ Les 2 gènes ont été transférés. Certains gènes-rapporteurs peuvent parfois être utilisés comme gènes marqueurs.

Gène LacZ codant pour la béta-galactosidase de la bactérie E coli

. L'activité enzymatique de la béta-galactosidase (hydrolyse des béta-galactosides) est mesurée avec un substrat (X-Gal = 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-béta-D-galactopyranoside) dont l'hydrolyse donne un produit coloré bleu.
X-Gal + H2O -----> Gal + X

La visualisation de l'activité enzymatique codée par le gène LacZ requiert la fixation préalable des tissus et ne peut donc pas être employé pour marquer des cellules vivantes. Aussi, l'existence d'activité béta-galactosidase endogène chez bon nombre de plantes fait que cette méthode est peu usitée (Hooykaas & Schilperoort, 1992).

Pour pouvoir métaboliser le X-gal, la cellule doit être exposée à un inducteur, l'isopropyl béta-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), proche du lactose. La méthode de selection basée sur le gène LacZ est destructive

gènes rapporteurs: LacZ gene, galactosidase

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Gène gus codant pour la béta-glucuronidase

Le gène gus, isolé d'Escherichia coli, code pour l'enzyme de la béta-glucuronidase capable d'hydrolyser certains composés glucuroniques. Cette enzyme, en présence du substrat X-Gluc (acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-béta-D-glucuronide) conduit à l'apparition d'un produit (précipité insoluble) de couleur bleue (Jefferson, 1987).

Quand ce gène rapporteur est fusionné avec le promoteur d'un gène d'intérêt, cette technique permet de visualiser ses territoires d'activité.

La méthode de selection basée sur le gène Gus est destructive

Gène codant pour la GFP (green fluorescent protein) de la méduse Aequora victoria

La GFP est une protéine de 27 kDa avec 2 sous-unités constituées de 1 tonneau (11 feuillet béta) entourant une hélice alpha porteuse d'un chromophore). Actuellement, la technique de microscopie de fluorescence utilisant des marqueurs GFP fait partie des méthodes les plus couramment utilisées en imagerie biologique.
La molécule fluorescente a la capacité d'adsorber de l'énergie lumineuse dite lumière d'excitation et de la restituer rapidement sous forme de lumière fluorescente ou lumière émise. L'émission de la lumière cesse dès l'arrêt de l'excitation.
Contrairement au gène LacZ, la visualisation de la GFP n'exige pas la fixation du tissu et ne nécessite pas de substrat chromogène. Il suffit de la soumettre à une radiation bleue ou UV pour observer une brillance verte. En plus, la GFP ne nécessite pas la destruction de l'échantillon étudié, ce qui permet notamment de faire une étude des variations de son expression au sein des mêmes tissus au cours du temps. Ce gène rapporteur, est donc particulièrement adapté pour suivre l'expression d'un transgène dans des cellules vivantes . La méthode de selection basée sur le gène la GFP est non destructive