Transgénèse chez les plantes. Etapes (isolement du gène d'intérêt, transfert par co-culture, ..)
مراحل تحوير المورثات عند النبات
La
transgénèse comporte plusieurs étapes dont 1/ Identification, isolement, intégration et multiplication d'un gène d'intérêt, 2/ Transfert du gène d'intérêt par différentes méthodes dont la co-culture, 3/ Régénération et évaluation des plantes transformées et 4/ Etape 4 : Incorporation du transgène
dans une variété commerciale et obtention d'une 'variété OGM'
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Etapes de la transgénèse chez les plantes
| Etapes de la transgénèse |
Outils et techniques associés |
1/ Repérage d'un caractère intéressant
dans une espèce donneuse: (bactéries, champignon,
plante...). Examen du génome
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Cartographie du génome
Séquençage
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| 2/ Identification de la protéine responsable de ce caractère
(ex : protéine toxique pour un insecte ravageur). |
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| 3/ Identification et isolement du gène d'intérêt
Obtention d'un mélange de fragments d'ADN. |
Enzyme de restriction.
Southern blot
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4/ Réalisation et amplification d'une construction génique
- Insertion d'un fragment d'ADN dans un plasmide
- Introduction du plasmide modifié dans le génome de la cellule hôte.
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Construction génique
Clonage d'un gène.
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5/ Transfert de l'ADN dans l'espèce receveuse
Introduction d'un ADN étranger ou remplacement d'un fragment
d'ADN
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- Vecteurs biologiques (bactéries, virus)
- Recombinaison homologue
- Fusion utilisant des liposomes
- Transfection
- Utilisation du polyéthylène glycol (PEG)
- Micro-injection in vitro
- Electroporation
- Canon à particules
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| 6/ Contrôle de l'efficacité du transfert chez
l'hôte par détection directe des transgènes
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Hybridation in situ
PCR
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| Sélection des cellules exprimant le gène ajouté
par tri |
Gène de sélection
Gènes rapporteurs
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Etape
1 : Identification, isolement, intégration et multiplication
d'un gène d'intérêt
La première étape est l'identification chez une espèce donneuse d'un caractère d'intérêt (résistance à certains insectes, à certaines maladies, à des herbicides, qualité nutritionnelle…) que l'on souhaite introduire dans une plante (espèce receveuse). Le gène d'intérêt
peut provenir de tout organisme vivant, bactérie, plante ou animal puisque le code génétique est universel. Ce gène doit être isolé de l'organisme donneur. Il est intégré
dans une construction génétique associant souvent un gène marqueur. Ce dernier permet de sélectionner les cellules qui ont intégré le gène d'intérêt.
La construction est ensuite multipliée (clonage) afin d'en disposer d'une quantité suffisante d'ADN pour son introduction dans les cellules végétales que l'on veut transformer.
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Caractère recherché
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Plante transformée (OGM)
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Résistance
aux insectes:
Les plantes transgéniques produisent leur propre toxine
Bt. Les toxines sont dites Bt car naturellement produites par
des bactéries, Bacillus thuringiensis que l'on trouve
dans le sol. Il y a plusieurs variantes de protéines Bt
(toxine
cry) conférant ainsi des résistances à des insectes spécifiques. La protéine Cry1Ab confère une résistance contre certains papillons.
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- Maïs-grain Bt résistant à la pyrale
- Pomme de terre Bt résistante au doryphore de la pomme
de terre
- Tomate Bt résistante aux lépidoptères
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Résistance
aux herbicides:
La plante transgénique produit une nouvelle protéine qui annule l'effet
toxique de l'herbicide dans la plante génétiquement
modifiée (PGM), La protéine normalement ciblée
par l'herbicide est remplacée par une nouvelle protéine
non sensible à l'herbicide
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- Maïs-grain
- Soja
- Lin
- Colza
- Coton
- Betterave sucrière
- Luzerne
- Riz
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Maturation
retardée:
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- Tomate
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Changement
de la composition nutritionnelle:
- Augmentation de la teneur en vitamine A
- Augmentation de la teneur en lysine, acide aminé essentiel
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- Riz doré
- Maïs
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Comment isole-t-on le gène d'intérêt ?
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ADN
Génomique provenant d'une banque d'ADN génomique (voir
TD)
- ADN complémentaire
(cDNA) résultant de l'ARN messager (mRNA) (voir TD)
Etape 2 : Transfert du gène d'intérêt
Il y a plusieurs méthodes pour introduire un gène dans une
cellule :
- Transfert direct
Cette technique fait intervenir :
- Transfert par bombardement par un canon à particules (biolistique).
Une projection d'ADN dans les cellules de la plante par l'utilisation d'un canon à particules qui projette dans les cellules des microparticules enrobées d'ADN (biolistique)
تقنية المسدس الجينى - Gene gun technique - طريقة لقذف الخلايا النباتية بالمادة الوراثية بعد تغليفها لجسيمات معدنية فلزية مثل كريات الدهب. تقدف الجسيمات بسرعة علية لتخترق جذار الخلايا و تنقل المورث المرغوب
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Transferts chimiques:
l'ADN peut être mélangé avec des lipides sous forme de liposome. La bicouche membranaire fusionne avec le liposome et l'ADN passe dans la cellule. Une autre méthode consiste à précipiter l'ADN avec du phosphate de Calcium qui sera plus facilement internalisé dans la cellule.
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Transfert sur protoplastes par fusion en présence du polyéthyléneglycol (PEG, méthode chimique). L'introduction d'ADN dans des protoplastes
est réalisée par action d'un agent chimique, le polyéthyléneglycol (PEG), une molécule capable d'induire la déstabilisation de la membrane plasmique permettant le transfert d'ADN à travers
celle-ci.
-Transfert sur protoplastes par électroporation (impulsion électrique).
L'électroporation des protoplastes, technique efficace et une
des plus simples à mettre en euvre, consiste à soumettre
un mélange de protoplastes et d'ADN à une série
de chocs électriques de courte durée et de tension élevée.
Le champ électrique provoque la déstabilisation de la
membrane plasmique par polarisation des phospholipides qui la constituent
et induit alors la formation de pores au travers desquels les molécules
d'ADN peuvent transiter. Si le choc électrique n'a pas été
trop violent, le phénomène est réversible et la
membrane reprend ensuite son état initial, laissant le protoplaste
parfaitement viable.
Limites : les techniques appliquées aux protoplastes végétaux
sont actuellement valables uniquement chez les espèces dont on
maîtrise la culture et la régénération de plantes à partir des protoplastes. Les progrès des méthodes de culture in vitro ont permis à des plantes comme le
riz d'être transformées à l'aide d'Agrobacterium.
Pour les espèces dont on ne maîtrise pas la régénération
des plantes en culture in vitro, on utilise le transfert direct
du gène d'intérêt.
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Transfert indirect par transformation biologique (co-culture)
Chez
les plantes, cette technique utilise une bactérie du sol, Agrobacterium,
qui a la propriété de réaliser naturellement la transformation génétique d'une plante, afin de la parasiter. Ainsi, une construction génétique introduite dans la bactérie
(rendue avirulente au préalable) sera transférée dans la plante et intégrée à son génome.
C'est la technique la plus couramment utilisée.
La transformation génétique est réalisée en mélangeant la culture d'une souche d'Agrobacterium transformée (et préalablement sélectionnée par culture in vitro sur les milieux appropriés), mise en suspension en milieu liquide, avec des explants de la plante, on parle de co-culture.
C'est
au cours de cette étape que la construction génétique introduite dans la bactérie est transférée dans
le génome de la plante.
Lors de la transformation, on utilise des disques foliaires, des sections de tige, des cotylédons, des embryons, des microspores ou des protoplastes. Par exemple, chez le tabac et la tomate, on utilise des disques foliaires ; chez la pomme de terre, la transformation génétique
peut se faire sur des protoplastes.
La co-culture doit permettre l'activation de la virulence des bactéries. Ainsi, le pH induisant la virulence des bactéries est souvent plus acide (pH inférieur à 5,7) que celui
de milieux utilisés pour la culture des végétaux (5,7-5,8). Aussi, certains sucres sont connus pour stimuler la virulence, et pourront être ajoutés au milieu de co-culture. Parfois,
le milieu de co-culture doit contenir des composés phénoliques activateurs de la virulence comme l'acétosyringone (voir image composite sur une nouvelle page).
Arrêt de la co-culture : élimination des agrobactéries
Une fois le transfert de gènes dans les cellules végétales
à partir des bactéries ait lieu (quelques heures de co-culture)
il faut éliner les bactéries restantes. En effet, leur
prolifération limite celle des cellules végétales
transformées. Il existe plusieurs techniques pour les éliminer
dont l'utilisation des bactériostatiques et des antibiotiques,
méthodes plus répandues pour l'élimination des
bactéries après la phase de co-culture et sans effet sur
les cellules végétales.
La majorité des plantes monocotylédones, dont les céréales,
resteréfractaire à la transformation par les agrobactéries.
Cette limitation importante avait conduit au développement de
procédés de transfert direct, mais également à
mieux affiner encore l'utilisation des agrobactéries.
