TRANSGENESE. METHODES DE TRANSFERT DES TRANSGENES (Agrobacterium tumefaciens comme vecteur, liposomes, électroporation, biolistique, ..),
تحوير المورثات. طرق نقل الجينات العابرة
SYSTEMES DE TRANSFERT PAR AGROBACTERIUM
أنظمة نقل الجينات العابرة بواسطة أكروبكتيريوم
On distingue deux méthodes de transfert des transgènes par Agrobacterium tumefaciens comme vecteur.
Système de transfert par co-intégration (plasmide navette)
Le plasmide Ti qui contient la région vir est maintenu dans Agrobacterium tumefaciens. Un plasmide intermédiaire de E.coli est utilisé pour faciliter le transfert du transgène.
les séquences bordures (24 paires de bases), indispensables,
sont placées sur le plasmide intermédiaire afin d'encadrer les gènes que l'on souhaite transférer aux plantes. Ce même plasmide est porteur du gène d'intérêt (+ gène de sélection végétale + gène
de sélection bactérienne). Il est sélectionnable
et il comporte une origine de réplication fonctionnelle chez
E.coli et Agrobacterium. Il s'intègre dans le plasmide
Ti par recombinaison homologue grâce à une région
homologue (souvent une séquence du plasmide pBR322 dont beaucoup
de plasmides dérivent), qu'ils possèdent tous les
deux. Ainsi, les régions vir et l'ADN-T vont se retrouver sur
le même plasmide. L'agrobactérie recombinante ainsi
obtenue ('plasmide navette'), peut alors être utilisée
pour transformer génétiquement des cellules végétales.
Les souches de l'agrobactérie recombinante choisie de façon
à combiner l'ensemble des gènes de virulence
en fonction de l'espèce végétale cible.
Par
définition, le 'plasmide navette' est un plasmide capable
de se répliquer dans deux organismes hôtes différents
car il porte deux origines de réplication différentes
et peut, par conséquent, être utilisé pour transférer
des gènes d'un hôte à autre. Synonyme: vecteur bifonctionnel.
Ici, il contient le gène de sélection pour les bactéries
(AmpR, par exemple) et le gène de sélection des plantes
recombinées (KanR, par exemple).
Called co-integrated vectors or hybrid Ti plasmids, these vectors were
among the first types of modified and engineered Ti plasmids devised for Agrobacterium-mediated transformation, but are not widely used today.These vectors are constructed by homologous recombination of a bacterial plasmid with the T-DNA region of an endogenous Ti plasmid in Agrobacterium.
Integration of the two plasmids requires a region of homology present
in both.
So by homologous recombination, co-integration of the two plasmid will
take place within Agrobacterium tumefaciens.This cointegrate vector
is used for transformation.
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Système de transfert binaire par conjugaison
triparentale (plasmide binaire)
Naturellement
les gènes vir et l'ADN-T sont sur le même plasmide. Cependant,
leur action est aussi possible en trans , effet résultant
de deux plasmides différents.
Le plasmide de virulence est maintenu
dans Agrobacterium tumefaciens. Le plasmide
binaire contenant l'ADN-T et préalablement construit
dans E. Coli, est introduit dans Agrobacterium tumefaciens
par électroporation ou par conjugaison bactérienne.
La présence des gènes vir va permettre le transfert
de l'ADN-T (gène de résistance et gène de sélection)
dans les cellules végétales. Un troisième plasmide
dit 'plasmide helper' qui ne peut
pas se répliquer chez Agrobacterium est également
utilisé pour améliorer le transfert du plasmide binaire
d'E. coli vers A. tumefaciens grâce à
ses gènes tra
(pour transfer) et mob (pour
mobilization) codant pour les protéines tra
et mob. C'est une conjugaison triparentale. Le plasmide
helper ne possèdant pas d'origine de réplication
d'Agrobacterium tumefaciens, est éliminé au
cours des divisions successives.
La
recombinaison permet d'additionner l'ADN des deux génomes plasmidiques. Ce nouveau vecteur, appelé vecteur binaire,
possède la capacité de se répliquer dans Agrobacterium
et aussi dans E. coli. Le plasmide recombiné ainsi obtenu,
transforme la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Les
bactéries réceptrices sont sélectionnées grâce au gène de sélection bactérien (AmpR
par exemple). Le plasmide Ti désarmé d'Agrobacterium
tumefaciens induira grâce à son gène de virulence,
le transfert de l'ADN-T recombiné dans l'autre plasmide (petit
plasmide). Pour rappel, les gènes de virulence sont naturellement
induits par des substances diffusées dans le sol par des cellules
végétales blessées (phénols, type acetosynringone),
qui stimulent un activateur de transcription à deux constituants
(Vir A+Vir G) spécifique pour l'ensemble des gènes de virulence.
La bactérie Agrobacterium tumefaciens infecte une culture
de cellules végétales susceptibles de donner une plante
entière, mise à pousser sur un milieu additionné de kanamycine (gène de sélection de la plante KanR). Les
clones cellulaires qui poussent ont reçu l'ADN T du plasmide
recombiné qui s'est intégré dans leur génome. Sur un milieu toujours additionné de kanamycine on laisse les
cals régénérer des plantes complètes. La kanamycine interfère avec la fonction plastidique et les plantes non résistantes sont blanches tandis que les plantes résistantes
sont vertes.
Binary
vector (also called as mini-Ti or micro Ti plasmid) consist of a
pair of plasmids: 1/ A disarmed Ti plasmid where the plasmid has T-DNA with gene of interest + Ori for both E.Coli and Agrobacterium and 2/ Helper Ti plasmid with the virulence region that mediates transfer of T-DNA (in micro Ti plasmid) to the plant.
Comment se déroule l'expérience de la conjugaison triparentale? (Thèse de doctorat de Karine Lièvre, 2004; publié en ligne)
Pour
réaliser la conjugaison triparentale, les bacteries sont d'abord mises en culture en milieu liquide :
- 1 colonie d'E.coli MC1061 contenant le plasmide portant l'ADN-T dans 2 ml de milieu LB additionnés des antibiotiques
correspondants.
- 1 colonie d'E.coli HB101 contenant le plasmide pRK2013
dans 2 ml de milieu LB additionnés de 25 µg/ml de kanamycine.
- 1 colonie d'Agrobacterium tumefaciens pGV2260 (Agrobacterium
désarmé) dans 2 ml de milieu YEB additionnés de 100 µg/ml d'ampicilline et de 100 µg/ml de rifampicine.
Ces souches d'Escherichia coli et d'Agrobacterium tumefaciens sont mises en culture sous agitation pendant une nuit, à 37°C et 26°C respectivement.
Des volumes de 100 µl de chacune des 3 cultures sont prélevés et mélangés dans un microtube sterile.
L'ensemble est étalé sterilement a l'aide d'un rateau sur un milieu YEB Mg2+.
Après une nuit de culture a 26°C, la conjugaison triparentale
est réalisée.
AUTRES METHODES DE TRANSFERT DES TRANSGENES CHEZ LES PLANTES
Transfert au génome nucléaire
- Explants + Agrobacterium tumefaciens (Barton et al.; Herrera-Estrella et al., 1983)
- Protoplastes + Polyéthylène glycol (Paszkoswski et al. 1984)
- Protoplastes + Liposomes (Caboche et al. 1985)
- Protoplastes + Micro-injection (Morikawa et al. 1985)
- Protoplastes + électroporation (Fromm et al. 1986)
- Graines + Agrobacterium tumefaciens (Feldman et Marks 1987)
- Explants + Biolistique (Sandford 1988)
- Explants + électroporation (d'Halluin et al. 1992)
- Plantes entières + Agrobacterium tumefaciens (Bechtold et al., 1993)
Transfert au génome chloroplastique
- Explants + Agrobacterium (de Block et al., 1985)
- Chlamydomonas + Biolistique (Boynton et al., 1988)
- Feuilles + Biolistique (Svab et al., 1990)
- Protoplastes + PEG (Golds et al., 1993)
On peut classer les méthodes de transfert des transgènes en 'transfert direct' et 'transfert indirect'.
Transfert direct
- Transfert physique par biolistique: bombardement par un canon à particules projetant dans les cellules cibles des microparticules enrobées d'ADN (biolistique)
- Transfert chimique par liposomes: l'ADN est mélangé avec des lipides sous forme de liposome qui franchit la bicouche membranaire et passe dans la cellule.
- Transfert chimique par le polyéthyléneglycol (PEG), une molécule capable d'induire la déstabilisation de la membrane plasmique permettant le transfert d'ADN dans les cellules
- Transfert sur protoplastes par électroporation. Un mélange d'ADN et de protoplastes est soumis à des chocs électriques de durée courte et de tension élevée. Il en résulte
la déstabilisation de la membrane plasmique par polarisation des phospholipides et la formation de pores au travers desquels l'ADN transite.
Transfert indirect par transformation biologique (coculture)
Explants + Agrobacterium tumefaciens (Barton et al.; Herrera-Estrella et al., 1983)
- Graines + Agrobacterium tumefaciens (Feldman et Marks 1987)
- Plantes entières + Agrobacterium tumefaciens
