Contrôle de la matière 'Marqueurs moléculaires et Amélioration des plantes' du module 'Biotechnologies et amélioration des plantes', parcours 'Biologie appliquée aux productions végétales', S6, Juin 2021 , Faculté Sciences-Semlalia, Université Cadi Ayyad, Marrakech, Morocco. Durée : 75 minutes
Cet examen traite la transformation génétique via Agrobacterium tumefaciens de la tomate pour la résistance à la sécheresse et la salinité.
Corrections brèves à la fin de l'épreuve ---- Liens à contenu similaire
Afin d'améliorer la résistance de la tomate à la sécheresse et la salinité, Khoudi et al., 2009 (Afr. J. Biotechnol. 8, 6068-6076) ont produit des plantes transgéniques exprimant le gène TVP1 codant pour une pyrophosphatase (construction génique 1) et le gène TNHX1 codant pour un antiport de sodium (construction génique 2).
Les deux gènes proviennent du blé. Ils sont connus par l'augmentation de la tolérance à la sécheresse et la salinité. Ils sont mis sous le contrôle d'un promoteur 35 S de CaMV (Fig. 1). La construction génique contient le gène BAR codant pour la résistance au glufosinate qui joue le rôle de gène de sélection.
Fig.1
Les
deux constructions géniques sont portées séparement par Agrobacterium tumefaciens, comme vecteur mis en coculture avec des explants de feuilles primaires de tomate.
L'ADN et l'ARN des plantes sont préparés à partir des feuilles. Les tests PCR sont réalisés séparement à l'aide de deux amorces spécifiques du gène
BAR et deux autres spécifiques du gène TVP1. Les paramètres de la PCR étaient les suivantes : une dénaturation initiale à 94°C, 5 min suivie de 35 cycles de 30 s à 94°C, 30 s à 50°C et 1 min 30 s à 72°C. Une période d'extension de 10 min à 72°C a été également appliquée à la fin des cycles d'amplification. Les ADN des amplifiats ont été séparés par
électrophorèse sur des gels d'agarose à 1 %. La PCR réalisée avec les amorces du gène BAR est représentée dans la figure 2.
Fig.2
Dans d'autres étapes de caractérisation des transfoprmants, la technique RT-PCR a été réalisée selon une réaction de transcription inverse pendant 1 h à 37°C. L'ADNc a été amplifié par PCR avec les deux paires d'amorces et dans les conditions décrites pour l'amplification de l'ADN des transformants. Les résultats obtenus avec les paires d'amorces du gène BAR et celles du gène TVP1, sont représentés dans Fig.3 (1) et Fig.3 (2), respectivement.
Fig.3
Les graines des plantes T1 (croisements T0) transformées par les gènes TVP1 et TNHX1 et témoins, ont été mises en germination et soumises à une irrigation en pots ou en hydroponie par une solution saline à NaCl 200 mM.
Les fréquences de transformation estimées à l'échelle des plantes T0 (par PCR avec les amorces du gèneBAR ) étaient respectivement 14% et 30%, pour les constructions géniques TVP1 (construction génique 1) et TNHX1 (construction génique 2). Ces fréquences étaient uniquement 4% et 10%, respectivement chez les plantes T1.
Contrairement aux plantes non transformées, les planes transgéniques T1, n'ont pas montré de jaunissement foliaire au bout de 15 jours de traitement avec le sel.
1. Décrivez brièvement, les principales méthodes
de transfert des transgènes utilisées dans les transformations génétiques des plantes.
2. A quels niveaux de transformation (réplication, transcription et traduction) et comment les auteurs ont fait usage du gène BAR pour l'analyse des transformants ?.
3. Les auteurs ont utilisé la technique RT-PCR dans les analyses moléculaires des tomates transformées. En rappeler brièvement le principe. Quelle est la différence principale entre ADN et ADNc ? .
4. Comment les auteurs ont vérifié
le niveau d'expression des transgènes dans les plants de tomate issus de graines (plantes T1) ?. Proposer d'autres méthodes de vérification possibles
5. Quels sont les avantages et les inconvénients de la culture de la tomate transformée génétiquement par les gènes TVP1 et TNHX1 selon la méthode décrite par les auteurs.
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REPONSES. DETAILS
Réponse
à la Question 1 : Description brève des principales
méthodes de transfert des transgènes utilisées
dans les transformations génétiques des plantes.
Transfert direct
- Transfert physique par biolistique: bombardement par un canon à particules projetant dans les cellules cibles des microparticules enrobées d'ADN (biolistique)
- Transfert chimique par liposomes: l'ADN est mélangé avec des lipides sous forme de liposome qui franchit la bicouche membranaire et passe dans la cellule.
- Transfert chimique par le polyéthyléneglycol (PEG), une molécule capable d'induire la déstabilisation de la membrane plasmique permettant le transfert d'ADN dans les cellules
- Transfert sur protoplastes par électroporation. Un mélange d'ADN et de protoplastes est soumis à des chocs électriques de durée courte et de tension élevée. Il en résulte
la déstabilisation de la membrane plasmique par polarisation des phospholipides et la formation de pores au travers desquels l'ADN transite.
Transfert indirect par transformation biologique (coculture)
Explants + Agrobacterium tumefaciens (Barton et al.; Herrera-Estrella et al., 1983)
- Graines + Agrobacterium tumefaciens (Feldman et Marks 1987)
- Plantes entières + Agrobacterium tumefaciens
Lien: Méthode de transfert des transgènes
Réponse à la Question 2: Usage du gène BAR pour l'analyse des transformants:
Niveaux de transformation (réplication, transcription et traduction):
le gène BAR (gène de sélection) a été utilisé
pour vérifier l'insertion du gène d'intérêt dans l'ADN des plants
de tomate en utilisant les deux amorces du gène de sélection (niveau
de la réplication de l'ADN). A ce niveau, les auteurs n'ont
pas utilisé de PCR avec les amorces des gènes d'intérêt (gène
TVP1 gouvernant la sécheresse et gène TNHX1 gouvernant
la salinité). Les auteurs n'ont pas, non plus, appliqué une pression
de sélection en cultivant les tissus de tomate en présence de l'herbicide,
glufosinate. De même, la formation d'ARN messager a été suivie
pa RT-PCR utilisant dans la PCR les amorces spécifiques du gène
BAR (Niveau de la transcription de l'ADN en ARN). La
PCR à l'aide des amorces du gène BAR a été utilisé pour
tester l'expression du transgène à l'échelle de la traduction.
Usage du gène BAR: La mise en évidence du gène
BAR a été réalisée par la PCR en utilisant les amorces
spécifiques du gène. Aucune culture des tissus ou plantes de tomate
en présence de l'herbicide glufosinate, n'a été réalisée.
Réponse à la Question 3:
Principe de la RT-PCR : la RT-PCR est basée sur la conversion
des ARNm préalablement purifiés, en ADNc. Ceci est obtenu par l'utilisation
d'une transcriptase reverse. L'ADNc obtenu est amplifié par PCR à
l'aide de deux amorces spécifiques du gène d'intérêt ou du gène
de sélection.
Lien : RT-PCR
Différence entre ADN et cDNA (ADNc): L'ADNc diffère de l'ADN par l'absence d'introns. Il reflète la succession des exons uniquement.
Lien: Transcription de l'ADN (DNA) en ARN (RNA). De même, l'ADNc est monocaténaire, alors que l'ADN est bicaténaire
Réponse à la Question 4 :
Vérification du niveau d'expression des transgènes dans les plants de tomate issus de graines (plantes T1): la vérification de l'expression (échelle de la traduction) du transgène réalisée par les auteurs, adopte l'usage de la PCR avec les amorces spécifique du gène de sélection BAR.
Autres méthodes de vérification possibles:
Les méthodes de vérification de l'expression du transgène à l'échelle de la traduction rentrent dans la caractérisation biochimique. Elles englobent :
- les tests utilisant des anticorps préparés contre la pyrophosphatase et/ou l'antiport de sodium, dont le test dot-blot d'immunodétection et le test ELISA
- les tests d'activités enzymatiques dont celle de la pyrophosphatase.
De même, l'application de l'herbicide glufosinate permet de repérer les plants de tomates exprimant le gène BAR (résistance à l'herbicide) lié aux gènes d'intérêt (résistance à la sécheresse et la salinité). Aussi, l'application du stress biotique (sécheresse, salinité) permet de vérifier, encore plus.
Réponse à la Question 5 :
Avantages de la culture de la tomate transformée génétiquement par les gènes TVP1 et TNHX1 selon la méthode décrite par les auteurs:
- Possibilité d'irrigation de la tomate avec des eaux salées et extension des cultures de la tomate.
- Economie d'eau dans l'irrigation
Inconvénients de la culture de la tomate transformée génétiquement par les gènes TVP1 et TNHX1:
- Rendements faibles de transformation génétique
- Risque de pollution par l'herbicide glufosinate lors des tests (dont contamination d'autres espèces interfertiles via le pollen).
LIENS UTILES
- TOMATE. CULTURE IN VITRO, EXAMEN
الزراعة الزجاجية للطماطم- TOMATO. IN VITRO CULTURE, EXAM
- Plantes. Transgénèse, génie génétique
- Transformation sens (chitinase)
- Chitinase engineered plants
- Chitinase. Tests
- RFLP
et sélection des protoplastes chez l'oranger. Examen S5_2012
- RFLP,
RAPD et sélection chez le Cyprès du Japon (examen 2013)
- Microsatellites
(SSR) et transgénèse chez le niébé. Examen S6 2017
- Polygalacturonase.
Transformation (contrôle)
- Transformation du bouleau avec la toxine BGT (contrôle)
- Culture de tomate au Maroc. Aperçu sur les recherches scientifiques
- Verticiliose de la tomate. Marqueurs RAPD (examen)
- Marqueurs de type RAPD et SSR dans le test de la pureté des semences de tomate (examen)
- Faire un Quiz formatif (Contrôle noté) sur les Biotechnologies des Plantes et Marqueurs moléculaires
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