biotechnologies

GENES RAPPORTEURS DANS LA TRANSGENESE ET EXPRESSION DES DES TRANSGENES CHEZ LES PLANTES



Aller au Sommaire du cours

- Faire un Quiz formatif (Contrôle noté) sur les Biotechnologies des Plantes et Marqueurs moléculaires

QCM Biotech

Visualisation de l'expression des transgènes

L'expression d'un transgène dépend de la présence d'un promoteur choisi pour permettre sa transcription afin de répondre aux tâches voulues comme: 1/ Synthèse plus ou moins accentuée d'une protéines, 2/ Expression exclusive voulue au niveau d'un organe précis de la plante (feuille, racine, graines…) et Expression lorsque des conditions environnementales précises (présence de parasites, température, …) sont réunies. Ce sont des régulations spatio-temporelles strictes.


Sur cette même page:

Visualisation de l'expression des transgènes à l'aide des gènes rapporteurs dans la transgénèse des plantes. Exemples de gènes rapporteurs dans la transgénèse des plantes
---- Gène LacZ codant pour la béta-galactosidase de la bactérie E coli.
---- Gène codant pour la GFP (green fluorescent protein)
---- Gène gus (béta-glucuronidase)

- Régulation de l'expression des gènes
- Fusion transcriptionnelle et fusion traductionnelle
- Gènes rapporteurs. Fusion transcriptionnelle et fusion traductionnelle


GENES RAPPORTEURS
Visualisation de l'expression des transgènes chez les plantes régénérées à l'aide des gènes rapporteurs dans la transgénèse des plantes

Comme pour le gène de sélection (gènes marqueurs), le choix du gène rapporteur doit se faire en fonction de la nature du matériel végétal. En effet, certaines plantes ont des activités endogènes qui sont capables de masquer l’expression d’un gène rapporteur.
Après transformation et régénération d’une plante, on peut distinguer 3 cas, dont 1/ La plante régénérée n’est pas transformée, mais naturellement résistante à l’agent de sélection, 2/ L’ADN-T peut avoir été transféré partiellement. Le gène de résistance à l’antibiotique est présent, mais pas le gène rapporteur (ou en partie) et 3/ Les 2 gènes ont été transférés. Certains gènes-rapporteurs peuvent parfois être utilisés comme gènes marqueurs.


Gène LacZ codant pour la béta-galactosidase de la bactérie E coli


. L'activité enzymatique de la béta-galactosidase (hydrolyse des béta-galactosides) est mesurée avec un substrat (X-Gal = 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-béta-D-galactopyranoside) dont l'hydrolyse donne un produit coloré bleu.

X-Gal + H2O -----> Gal + X

X-gal, galactosidase

La visualisation de l'activité enzymatique codée par le gène LacZ requiert la fixation préalable des tissus et ne peut donc pas être employé pour marquer des cellules vivantes. Aussi, l'existence d'activité béta-galactosidase endogène chez bon nombre de plantes fait que cette méthode est peu usitée (Hooykaas & Schilperoort, 1992).

Pour pouvoir métaboliser le X-gal, la cellule doit être exposée à un inducteur, l'isopropyl béta-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), proche du lactose.

LacZ gene, galactosidase

Gène codant pour la GFP (green fluorescent protein) de la méduse Aequora victoria


La GFP est une protéine de 27 kDa avec 2 sous-unités constituées de 1 tonneau (11 feuillet béta) entourant une hélice alpha porteuse d'un chromophore). Actuellement, la technique de microscopie de fluorescence utilisant des marqueurs GFP fait partie des méthodes les plus couramment utilisées en imagerie biologique.

La molécule fluorescente a la capacité d'adsorber de l'énergie lumineuse dite lumière d'excitation et de la restituer rapidement sous forme de lumière fluorescente ou lumière émise. L'émission de la lumière cesse dès l'arrêt de l'excitation.
Contrairement au gène LacZ, la visualisation de la GFP n'exige pas la fixation du tissu et ne nécessite pas de substrat chromogène. Il suffit de la soumettre à une radiation bleue ou UV pour observer une brillance verte. En plus, la GFP ne nécessite pas la destruction de l'échantillon étudié, ce qui permet notamment de faire une étude des variations de son expression au sein des mêmes tissus au cours du temps. Ce gène rapporteur, est donc particulièrement adapté pour suivre l'expression d'un transgène dans des cellules vivantes .

FGP, green fluorescent protein

Gène gus codant pour la béta-glucuronidase


Le gène GUS, isolé d'Escherichia coli, code pour l'enzyme de la béta-glucuronidase capable d'hydrolyser certains composés glucuroniques. Cette enzyme, en présence du substrat X-Gluc (acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-béta-D-glucuronide) conduit à l'apparition d'un produit (précipité insoluble) de couleur bleue (Jefferson, 1987).

GUS, gène rapporteur
Quand ce gène rapporteur est fusionné avec le promoteur d'un gène d'intérêt, cette technique permet de visualiser ses territoires d'activité.
Glucuronidase


Régulation de l'expression des gènes

On peut schématiser un gène comme constitué de 3 éléments : 1/ promoteurs et signaux de contrôle (ou régulation) de la transcription, région transcrite, signal d'arrêt de la transcription. Le promoteur de transcription est une séquence de quelques nucléotides permettant à l'ARN polymérase (secondée par divers facteurs de transcription) de s'accrocher à l'ADN pour démarrer sa transcription, ou synthèse de l'ARN messager (ARNm). Visualiser la régulation de l'expression des gènes sur une nouvelle fenêtre

RNA polymerase, promoteur, activateur, represseur, enhancer

Il y'a promoteurs et promoteurs!

Le promoteur d'un gène est une séquence courte d'ADN, généralement située en amont du gène, qui en contrôle l'expression, en régulant sa transcription. Il existe 2 types de promoteurs:

Promoteurs constitutifs
- Peuvent s'exprimer dans toute la plante.
- Expression peu specifique et mal controlée dans le temps et l'espace

Promoteurs inductibles
- Activation d'un promoteur en réponse a la présence d'un composé particulier (= inducteur) ou bien à une condition externe definie (ex : temperature élevée)
- Le transgene est exprimé a un stade precis de developpement et pendant une durée precise.

- Contrôle du transgene: spatialement (cellule ou tissu -specifique) et quantitativement
- Contrôle par différents produits comme la tetracycline, les steroides, le dexaméthasone, l'oestradiol ou l'éthanol ....)

Il existe deux groupes de promoteurs inductibles:

---- Promoteurs inductibles régulés chimiquement (chemically-regulated): action sur le promoteur de composés chimiques inhabituels à la plante

---- Promoteurs inductibles régulés physiquement (physically-regulated): les facteurs externes abiotiques (lumière, température bléssures mécaniques, ...) induisent l'activité du promoteur

Plus ou moins loin des promoteurs, existent des éléments de contrôle, appelés 'enhancers' et 'silencers'. Lorsque des protéines régulatrices s'y attachent, l'effet est respectivement de faciliter ou d'empêcher l'accès de l'ARN polymérase au promoteur, ce qui conduit à l'augmentation ou la diminution de la transcription. Ces séquences et la présence ou non dans chaque cellule des protéines qui les reconnaissent permettent une régulation extrêmement fine de la transcription des gènes.

Un gène eucaryote naturel ou chimérique peut être cloné, c'est à dire introduit et amplifié dans un clone bactérien. Mais il n'y sera pas exprimé, c'est à dire ne sera ni transcrit, ni traduit, s'il n'est pas pourvu des séquences requises pour l'accrochage de l'ARN polymérase bactérienne. Lorsqu'il est transféré dans une cellule totipotente; s'il s'intègre dans son génome, la cellule sera dite transformée ou transgénique ou génétiquement modifiée, et le nouveau gène sera qualifié de transgène. Une plante qui résulte de la multiplication et de la différenciation de cette cellule possèdera le transgène dans toutes ses cellules, mais ne l'exprimera que dans celles où le promoteur choisi permet sa transcription pour répondre aux tâches voulues comme: 1/ Synthèse plus ou moins accentuée d'une protéines, 2/ Expression exclusive voulue au niveau d'un organe précis de la plante (feuille, racine, graines…) et Expression lorsque des conditions environnementales précises (présence de parasites, température, …) sont réunies. Ce sont des régulations spatio-temporelles strictes. Pour obtenir une telle expression régulée du transgène, il faut placer la séquence à transcrire sous contrôle d'un promoteur répondant aux conditions requises.

Une autre manière de faire taire les gènes

Une autre manière de moduler l'expression de gènes dans des plantes réside dans l'utilisation d'ARN antisens ou ARN interférants. En effet, la synthèse par un transgène d'un ARN complémentaire à un ARN messager naturellement présent dans la plante, peut conduire à la dégradation de cet ARNm, d'où l'absence de synthèse de la protéine (voir transgénèse. transformation antisens).

Universalité ou non de la régulation de l'expression des gènes?

Les promoteurs et terminateurs de transcription, séquences régulatrices, ARN polymérases, facteurs de transcription, ne sont pas universels. En plus des différences entre procaryotes et eucaryotes, ils ne sont pas identiques entre animaux et végétaux et même entre monocotylédones et dicotylédones.
Les signaux de régulation, le promoteur et le terminateur de transcription (dans la construction d'un gène chimérique comportant la séquence codante) doivent provenir d'un organisme le plus proche possible du receveur pour assurer la fabrication d'une nouvelle protéine par les cellules d'un organisme.
Ainsi, les transgènes végétaux doivent être pourvus de signaux de régulation qui permettront à l'ARN polymérase de les transcrire, selon l'objectif visé, dans le noyau de toutes les cellules de la plante transgénique (expression constitutive) ou dans uniquement dans le noyau des cellules appartenant à un tissu ou un organe ciblé et/ou seulement en réponse à stimulus externe précis (expression régulée). On parle de fusion transcriptionnelle.

Fusion transcriptionnelle et fusion traductionnelle

- Fusion transcriptionnelle : pour être capable de s'exprimer dans une plante, un gène doit être pourvu des séquences de type végétal régulant sa transcription. Si l'on veut une expression uniquement dans les feuilles, on choisira un promoteur fonctionnant seulement dans les noyaux des cellules de feuilles (avec enhancers et silencers ad hoc). Par contre la séquence codante peut avoir n'importe quelle origine, dès lors qu'elle aura été transcrite en ARN, la séquence codante de tout gène pourra être traduite en protéine selon le code universel. Les séquences 5' et 3' NTR peuvent provenir du gène auquel on a emprunté les séquences régulatrices, on parle dans ce cas de fusion transcriptionnelle, car comme l'ADN, l'ARN fruit de sa transcription, sera chimérique.

- Fusion traductionnelle : si on souhaite que la nouvelle protéine, dans les cellules où elle sera synthétisée, soit localisée dans un compartiment cellulaire particulier, il faut lui adjoindre la séquence permettant l'adressage correct. On opère alors la recombinaison in vitro entre la séquence codant le peptide d'adressage (et les acides aminés nécessaires à sa séparation ultérieure de la protéine ayant atteint son adresse) et celle codant la protéine nouvelle à adresser. Comme non seulement l'ADN et l'ARN, mais également la protéine résultant de la traduction, se trouveront avoir des origines différentes, on parlera alors de fusion traductionnelle.

La fusion traductionnelle est une fusion de protéines conduisant à la synthèse d'une protéine hybride, alors que la fusion transcriptionnelle est une fusion de gènes conduisant à la synthèse de 2 protéines séparées. Chaque stratégie a ses avantages et ses inconvénients. Ainsi dans une fusion traductionnelle, il arrive parfois que les protéines ne parviennent pas à s'associer correctement, auquel cas la protéine hybride perd les activités biologiques des 2 protéines présentes à l'état séparé de départ. Une fusion traductionnelle chez K12 est constituée d'un ensemble promoteur + RBS + gene1 (sans stop) + gene2 complet fusionné en phase, alors qu'une fusion transcriptionnelle est constituée d'un ensemble promoteur + RBS1 + gene1 (complet) + RBS2 + gène2 (complet).
La fusion transcriptionnelle rend compte de la capacité de transcription d'une séquence d'ADN étudiée. Par exemple, on additionne un promoteur de gène à un gène rapporteur comme GUS et on suit la coloration bleue des territoires où le gène va s'exprimer. Ainsi, dans le cas d'un stress, les zones où les gènes impliqués dans la lutte contre le stress s'expriment, deviennent visibles. Il suffit de tremper les plantes dans le substrat de la béta-glucuronidase. Ceci aide à connaître le rôle des gènes.
La fusion traductionnelle peut rendre compte de la transcription et de la traduction des gènes, en même temps.

Liens utiles :
http://svtlouisarmand.free.fr/public/animations_flash/plante_transgenique.swf


Gènes rapporteurs. Fusion transcriptionnelle et fusion traductionnelle

La fusion transcriptionnelle (transcriptional fusion) consiste en une fusion de gènes intervenant dans la région transcrite mais non traduite. La fusion traductionnelle est une fusion de gènes effectuée dans leur partie codante et respectant les cadres de lecture. Visualiser les deux types de fusion sur une nouvelle fenêtre.

Gènes. Fusions transcriptionnelle, traductionnelle

LIENS UTILES:

---> Aller au Sommaire du cours
- Gène. Structure
- Génie génétique. Cours
- Biologie moléculaire et génie génétique. Liens
- Génie génétique. QCM de base (FR, Ar)
- Clonage des gènes. QCM -
- Microsatellites (SSR) et transgénèse chez le niébé. Examen S6 2017
- Revenir à la page du Module Biotechnologies et Amélioration

- Faire un Quiz formatif (Contrôle noté) sur les Biotechnologies des Plantes et Marqueurs moléculaires

QCM Biotech


Partager cette information sur les réseaux sociaux تبادل المعلومة عبر المواقع الإجتماعية
facebook Twitter Linkedin

biotechnologies

  • SUJETS/PLANTES

  • Palmier dattier Palmier dattier نخيل التمر Date palm

    Read More

  • Olivier Olivier الزيتون Olive

    Read More

  • Pin Alep Pin d'Alep الصنوبر الحلبي Aleppo pine

    Read More

  • Atriplex Atriplex القطف Atriplex

    Read More

  • Céréales Céréales الحبوب Cereals

    Read More

  • Cactus Cactus الصبار Cactus

    Read More


  • Biotech-ecolo. net. SUPPORTS Youtube chaine

    CHAINE YOUTUBE Chaine Youtube (abonnement). Plusieurs vidéos multilingues (+ s/titres) aux sujets des Biotechnologies et Biochimie


    OUVRAGES
  • 400 QCM et Concours (Ar, Fr) sur Structure et Métabolisme des Sucres, M. Baaziz, 2018:
    - Présentation du livre
    - Affiche du Livre

    Sucres
  • Glossaire trilingues Français-Arabe-Anglais
    Glossaire

  • - Livre 'Sciences de la vie. Protéines et Enzymes' (+ DVD),Baaziz, 2013: QCM corrigés, Exercices corrigés, Contrôles corrigés en Biologie cellulaire et Biochimie pour S1, S3, S4 et S5.


  • EN RAPPORT AVEC BIOCHIMIE, BIOTECHNOLOGIES

    Adresse

    Faculty of Sciences, Cadi Ayyad University
    Marrakech, 40000, Morocco

    FORMULAIRE POUR CONTACT

    Email: baaziz@uca.ac.ma
    Phone: 212524434649 (post 513)
    Fax: 212524434669

    transgénèse. Gènes rapporteurs, expression des transgènes