biotechnologies

TRANSGENESE. METHODES DE TRANSFERT DES TRANSGENES


SYSTEMES DE TRANSFERT PAR AGROBACTERIUM

On distingue deux méthodes de transfert des transgènes par Agrobacterium tumefaciens.
Système de transfert par co-intégration (plasmide navette)
Le plasmide Ti qui contient la région vir est maintenu dans Agrobacterium tumefaciens. Un plasmide intermédiaire de E.coli est utilisé pour faciliter le transfert du transgène. les séquences bordures (24 paires de bases), indispensables, sont placées sur le plasmide intermédiaire afin d’encadrer les gènes que l’on souhaite transférer aux plantes. Ce même plasmide est porteur du gène d'intérêt (+ gène de sélection végétale + gène de sélection bactérienne). Il est sélectionnable et il comporte une origine de réplication fonctionnelle chez E.coli et Agrobacterium. Il s'intègre dans le plasmide Ti par recombinaison homologue grâce à une région homologue (souvent une séquence du plasmide pBR322 dont beaucoup de plasmides dérivent), qu’ils possèdent tous les deux. Ainsi, les régions vir et l'ADN-T vont se retrouver sur le même plasmide. L'agrobactérie recombinante ainsi obtenue ('plasmide navette'), peut alors être utilisée pour transformer génétiquement des cellules végétales. Les souches de l'agrobactérie recombinante choisie de façon à combiner l’ensemble des gènes de virulence en fonction de l’espèce végétale cible.

Par définition, le 'plasmide navette' est un plasmide capable de se répliquer dans deux organismes hôtes différents car il porte deux origines de réplication différentes et peut, par conséquent, être utilisé pour transférer des gènes d'un hôte à autre. Synonyme: vecteur bifonctionnel. Ici, il contient le gène de sélection pour les bactéries (AmpR, par exemple) et le gène de sélection des plantes recombinées (KanR, par exemple).

Agrobacterium tumefaciens recombinant. Co-intégration

Called co-integrated vectors or hybrid Ti plasmids, these vectors were among the first types of modified and engineered Ti plasmids devised for Agrobacterium-mediated transformation, but are not widely used today. These vectors are constructed by homologous recombination of a bacterial plasmid with the T-DNA region of an endogenous Ti plasmid in Agrobacterium. Integration of the two plasmids requires a region of homology present in both. So by homologous recombination, co-integration of the two plasmid will take place within Agrobacterium tumefaciens.This cointegrate vector is used for transformation.

- Système de transfert binaire par conjugaison triparentale (plasmide binaire)

Naturellement les gènes vir et l'ADN-T sont sur le même plasmide. Cependant, leur action est aussi possible en trans , effet résultant de deux plasmides différents.
Le plasmide de virulence est maintenu dans Agrobacterium tumefaciens. Le plasmide binaire contenant l'ADN-T et préalablement construit dans E. Coli, est introduit dans Agrobacterium tumefaciens par électroporation ou par conjugaison bactérienne. La présence des gènes vir va permettre le transfert de l'ADN-T (gène de résistance et gène de sélection) dans les cellules végétales. Un troisième plasmide dit 'plasmide helper' qui ne peut pas se répliquer chez Agrobacterium est également utilisé pour améliorer le transfert du plasmide binaire d’E. coli vers A. tumefaciens grâce à ses gènes tra (pour transfer) et mob (pour mobilization) codant pour les protéines tra et mob. C’est une conjugaison triparentale. Le plasmide helper ne possèdant pas d’origine de réplication d’Agrobacterium tumefaciens, est éliminé au cours des divisions successives.

Agrobacterium recombinant binaire

La recombinaison permet d'additionner l'ADN des deux génomes plasmidiques. Ce nouveau vecteur, appelé vecteur binaire, possède la capacité de se répliquer dans Agrobacterium et aussi dans E. coli. Le plasmide recombiné ainsi obtenu, transforme la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Les bactéries réceptrices sont sélectionnées grâce au gène de sélection bactérien (AmpR par exemple). Le plasmide Ti désarmé d'Agrobacterium tumefaciens induira grâce à son gène de virulence, le transfert de l'ADN-T recombiné dans l'autre plasmide (petit plasmide). Pour rappel, les gènes de virulence sont naturellement induits par des substances diffusées dans le sol par des cellules végétales blessées (phénols, type acetosynringone), qui stimulent un activateur de transcription à deux constituants (Vir A+Vir G) spécifique pour l'ensemble des gènes de virulence.
La bactérie Agrobacterium tumefaciens infecte une culture de cellules végétales susceptibles de donner une plante entière, mise à pousser sur un milieu additionné de kanamycine (gène de sélection de la plante KanR). Les clones cellulaires qui poussent ont reçu l'ADN T du plasmide recombiné qui s'est intégré dans leur génome. Sur un milieu toujours additionné de kanamycine on laisse les cals régénérer des plantes complètes. La kanamycine interfère avec la fonction plastidique et les plantes non résistantes sont blanches tandis que les plantes résistantes sont vertes.

Binary vector (also called as mini-Ti or micro Ti plasmid) consist of a pair of plasmids: 1/ A disarmed Ti plasmid where the plasmid has T-DNA with gene of interest + Ori for both E.Coli and Agrobacterium and 2/ Helper Ti plasmid with the virulence region that mediates transfer of T-DNA (in micro Ti plasmid) to the plant.

Comment se déroule l'expérience de la conjugaison triparentale? (Thèse de doctorat de Karine Lièvre, 2004; publié en ligne)

Pour réaliser la conjugaison triparentale, les bacteries sont d'abord mises en culture en milieu liquide :
- 1 colonie d'E.coli MC1061 contenant le plasmide portant l'ADN-T dans 2 ml de milieu LB additionnés des antibiotiques correspondants.
- 1 colonie d'E.coli HB101 contenant le plasmide pRK2013 dans 2 ml de milieu LB additionnés de 25 µg/ml de kanamycine.
- 1 colonie d'Agrobacterium tumefaciens pGV2260 (Agrobacterium désarmé) dans 2 ml de milieu YEB additionnés de 100 µg/ml d'ampicilline et de 100 µg/ml de rifampicine.
Ces souches d'Escherichia coli et d'Agrobacterium tumefaciens sont mises en culture sous agitation pendant une nuit, a 37°C et 26°C respectivement. Des volumes de 100 µl de chacune des 3 cultures sont prélevés et mélangés dans un microtube sterile. L'ensemble est étalé sterilement a l'aide d'un rateau sur un milieu YEB Mg2+. Après une nuit de culture a 26°C, la conjugaison triparentale est réalisée.

AUTRES METHODES DE TRANSFERT DES TRANSGENES
Procédés de transfert des gènes chez les plantes
transgènes. Systèmes de transfert

Transfert au génome nucléaire
- Explants + Agrobacterium tumefaciens (Barton et al.; Herrera-Estrella et al., 1983)
- Protoplastes + Polyéthylène glycol (Paszkoswski et al. 1984)
- Protoplastes + Liposomes (Caboche et al. 1985)
- Protoplastes + Micro-injection (Morikawa et al. 1985)
- Protoplastes + Électroporation (Fromm et al. 1986)
- Graines + Agrobacterium tumefaciens (Feldman et Marks 1987)
- Explants + Biolistique (Sandford 1988)
- Explants + Électroporation (d'Halluin et al. 1992)
- Plantes entières + Agrobacterium tumefaciens (Bechtold et al., 1993)

Transfert au génome chloroplastique
- Explants + Agrobacterium (de Block et al., 1985)
- Chlamydomonas + Biolistique (Boynton et al., 1988)
- Feuilles + Biolistique (Svab et al., 1990)
- Protoplastes + PEG (Golds et al., 1993)
Le devenir du transgène dépend du type de vecteur
Le transgène peut être reconnu par la machinerie cellulaire s'il porte des signaux de reconnaissances. S'il s'agit de signaux de réplication, cela entraînera une réplication. S'il s'agit de signaux de transcription et de traduction, il s'en suivra une transcription et une traduction, respectivement. Tout dépend du type de vecteur (vecteur de clonage, vecteur d'expression). Par rapport aux vecteurs de clonage, les vecteurs d'expression possèdent, en plus, un promoteur et un terminateur.

vecteurs. Clonage, expression

Aller aux gènes rapporteurs et expression des gènes



QCM connaissances de base de la transgénèse et les OGMs,

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    Transgénèse, génie génétique