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Bouleau (Betula platyphylla). Transformation génétique pour la résistance au lépidoptère Lymantria dispar (Bombyx disparate)


Contrôle de la matière 'Marqueurs moléculaires et Amélioration des plantes' du module 'Biotechnologies et amélioration des plantes', parcours 'Biologie appliquée aux productions végétales', S6, Juin 2018 ", Faculté Sciences-Semlalia, Université Cadi Ayyad, Marrakech, Maroc. Durée : 75 minutes .......... Corrections brèves à la fin de l'épreuve----> Liens à contenu similaire

Afin d'améliorer la résistance du bouleau (Betula platyphylla Suk) au lépidoptère Lymantria dispar (Bombyx disparate), Zeng et al., 2009 (AJB 8, 3392-98) ont produit des plantes transgéniques exprimant le gène bgt codant pour une protéine insecticide (BGT) résultant de la fusion d'une toxine produite par l'araignée (Atrax robustus) et la toxine Cry IA (b) de la bactérie Bacillus thuringiensis.
bouleau, betula, Bombyx
Le transfert a été réalisé par Agrobacterium tumefaciens hébergeant un T-DNA avec le gène bgt et les gènes de la néomycine phosphotransférase (nptII) et de la béta-glucuronidase (uidA ou gus) (fig. 1). L'ADN et l'ARN des plantes sont préparés à partir des feuilles. L'ADN génomique a été hydrolysé par l'enzyme de restriction PstI et séparé par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%. Après transfert sur membrane et hybridation avec la sonde bgt, les résultats sont montrés dans la figure 2. Après élimination de la sonde bgt, la membrane a été révélée de nouveau avec la sonde gus (uidA). Le résultat obtenu est montré dans la figure 3.
L'ARN total a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose 1%. Après transfert sur membrane, l'hybridation a été réalisé par la sonde bgt. Le résultt est montré dans la figure 4.
Le niveau d'expression en protéine BGT a été suivi par ELISA avec quantification des protéines. Les résultats sont montrés dans le tableau 1. L'effet insecticide de la protéine BGT a été test par impact des larves de Lymantria dispar sur les plantes de Betula platyphylla transformées et non transformées (Fig.5).
bouleau T-DNA
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Southern blot
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gènes bgt, gus
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northern
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copies transgène
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betula et lépidoptère
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1. A l'aide d'un tableau comparer les marqueurs RFLP et ceux basés sur la PCR, utilisés dans la détermination du nombre de copies de transgènes intégrés dans un génome.
2. Quelle(s) est (sont) la (les) figure (s) pouvant rendre compte du nombre de copies du transgène bgt integrées dans le génome des plantes ayant subi la transformation.
3. Comparer le nombre de copies du transgène bgt et du gène gus integrées dans le génome des plantes. Proposer des hypothèse explicatives.
4. En exploitant le tableau 1 et les autres figures, préciser le niveau d'expression (échelle de la transcription) du transgène intégré dans le génome des plantes. Proposer des hypothèse explicatives.
5. A l'aide du tableau 1, déterminer s'il existe une relation entre le taux de la protéine insecticide, le nombre de copie du transgène et le niveau d'expression.
6. En s'inspirant de la figure 5, évaluer les apports positifs et négatifs de l'usage de la transformation génétique du bouleau pour la résistance au lépidoptère Lymantria dispar.


DETAILS DES REPONSES....


REPONSES BREVES


--> Revenir aux questions
Réponse à la Question 1: Détermination du nombre de copies du transgène. Usages des marqueurs RFLP et ceux basés sur la PCR.
Etape RFLP PCR cas de la PCR inverse
Purification de l'ADN Requise Requise
Digestion par une enzymes de restriction coupant dans: le transgène la région bordant le gène
Ligation après coupure Non Oui
Deuxième hydrolyse sur le transgène Non Oui
Amplification de l'ADN, amorces spécifiques du transgène Non Oui
Transfert (Southern blot) Oui Non
Détection par hybridation avec une sonde spécifique du transgène Oui Non

Lien: Nombre de copies du transgène intégré


Réponse à la Question 2: La (les) figure (s) pouvant rendre compte du nombre de copies du transgène bgt integrées dans le génome des plantes ayant subi la transformation. Ce sont la figures 2 et 3 correspondant au southern blots. La figure 3 correspondant à l'hybridation avec une sonde détectant le gène gus (gène marqueur) lié au transgène bgt (gène d'intérêt), peut rendre compte indirectement du nombre de copies du transgène. La coupure par l'enzyme pstI se fait dans le transgène. La majorité des plantes (6/9, environ 67%) incorporent 3 copies du transgène. Une à deux plantes incorporent 4 copies. Une seule plante avec une copie et une autre avec deux (Fg.2).

Réponse à la Question 3: Comparaison du nombre de copies du transgène bgt et du gène gus integrées dans le génome des plantes. Quelles hypothèse explicatives ?.
La figure 3 montre que le nombre de copies deu transgène bgt et du gène gus ne concordent pas. Ainsi, la plante TP69 présente 3 copies de bgt et 4 copies de gus. Ceci peut être expliqué par des réarragements et des délétions de gènes lors de l'intégration de l'ADN T.

Réponse à la Question 4: le niveau d'expression (échelle de la transcription) du transgène intégré dans le génome des plantes. Quelles hypothèse explicatives?
Lintensité des bandes de la figure 4, montre que le niveau d'expression (échelle de la transcription) du bgt est différent d'une plante à l'autre. L'expression est élevée chez les plantes TP28, TP46 et TP58. Cependant les plantes TP30 et TP96 n'expriment pas le gene bgt

Réponse à la Question 5:y a-t-il une relation entre le taux de la protéine insecticide, le nombre de copie du transgène et le niveau d'expression ?.
L'absence de la protéines BGT dans les plantes TP30 et TP 96 est en accord avec l'absence de transcrits ARNm, montré par la figure 4 (Northern blotting), malgré que ces plantes contenaient une et 4 copies du transgène, respectivement. La protéine BGT est bien représentée chez les plantes TP23 et TP28, porteuse respectivement de tois et une copies du transgène bgt. Tous ces résultats montre l'absence de corrélations entre le nombre de copies du transgène et son expression en protéine BGT.

Réponse à la Question 6: Les apports positifs et négatifs de l'usage de la transformation génétique du bouleau pour la résistance au lépidoptère Lymantria dispar. Les tests biologiques confirment bien la toxicité des plantes transgéniques de Betula platyphylla envers les larves de Limantria. Les apports positifs de cette transformation peuvent se résumer dans l'élimination d'usage excessif des insecticides pour lutter contre les lépidoptères (protection de l'environnement). Néanmoins, le transfert horizontal du transgène à d'autres espèces les rendant toxiques pour d'autres insctes non nuisibles et la pollution génique (transfert du pollen sur d'autres espèces), restent des risques à en tenir compte.


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LIENS UTILES:


- Plantes. Transgénèse, génie génétique
- Transformation sens (chitinase)
- Chitinase engineered plants
- Chitinase. Tests
- RFLP et sélection des protoplastes chez l'oranger. Examen S5_2012
- RFLP, RAPD et sélection chez le Cyprès du Japon (examen 2013)
- RAPD et sélection de la tomate. Examen S5_2012
- Microsatellites (SSR) et transgénèse chez le niébé. Examen S6 2017
- Polygalacturonase. Transformation (contrôle)


Diversité génétique

Bouleau. Transformation génétique. Examen